В книге "Эволюция: классические идеи в свете новых открытий" в подразделе "Эволюция под управлением компьютера" описан интереснейший эксперимент под авторством Paegel, Joyce (2008). К сожалению, в процессе чтения осознал, что не полностью могу схватить то, как именно функционирует размножение используемого в эксперименте рибозима. Отрывок из книги:
Этот рибозим — РНК-лигаза класса I — был искусственно получен в 1993 году. Его функция состоит в том, что он катализирует присоединение (лигирование) другой молекулы РНК к самому себе. Субстратом (присоединяемой молекулой) может служить не всякая цепочка нуклеотидов: она должна содержать участок, комплементарный одному из участков рибозима. Комплементарные участки рибозима и субстрата соединяются водородными связями, образуя «уотсон-криковские» пары. При этом свободные концы субстрата и рибозима оказываются рядом. Концы «сшиваются» — происходит лигирование.
В качестве субстрата использовался олигонуклеотид смешанной природы: короткая молекула РНК, присоединенная к более длинной молекуле ДНК. Главная хитрость в том, что ДНК-овая часть субстрата содержит промотор, т. е. участок, к которому может прикрепиться фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза. Этот фермент осуществляет транскрипцию, т. е. синтез РНК на матрице ДНК. Без промотора молекула ДНК не может быть транскрибирована.
Благодаря наличию промотора в молекуле субстрата рибозим РНК-лигаза приобретает требуемое свойство — способность размножаться, но только при условии успешного выполнения рибозимом своей функции.
Для того чтобы рибозим начал размножаться, нужно добавить в среду два фермента: ДНК-зависимую РНК-полимеразу и обратную транскриптазу — фермент, осуществляющий синтез ДНК на матрице РНК (обратную транскрипцию). Вдвоем эти ферменты успешно осуществляют синтез копий рибозима, но только в том случае, если рибозим предварительно присоединил к себе субстрат с промотором. При размножении копируется не вся молекула (рибозим вместе с присоединенным субстратом), а только сам рибозим.
т. е. лигирующий рибозим присоединяет к себе олигонуклеотид смешанной природы (РНК + ДНК с промотором). с получившимся комплексом (рибозим + смешанный олигонуклеотид) взаимодействуют два энзима (ДНК-зависимая-РНК-полимераза и обратная транскриптаза) и конечным итогом взаимодействия является размножение рибозимной лигазы. но как именно оно осуществляется, если обратная транскриптаза может работать только по РНК-составляющей части получившегося комплекса, а ДНК-зависимая-РНК-полимераза - по ДНК-составляющей?..
Возможно, ответ очевиден, но я почему-то упускаю, не обессудьте, разъясните пожалуйста ) Спасибо!
PLoS Biol. 2008 Apr 8;6(4):e85. doi: 10.1371/journal.pbio.0060085.
Darwinian evolution on a chip.
Paegel BM1, Joyce GF.
Computer control of Darwinian evolution has been demonstrated by propagating a population of RNA enzymes in a microfluidic device. The RNA population was challenged to catalyze the ligation of an oligonucleotide substrate under conditions of progressively lower substrate concentrations. A microchip-based serial dilution circuit automated an exponential growth phase followed by a 10-fold dilution, which was repeated for 500 log-growth iterations. Evolution was observed in real time as the population adapted and achieved progressively faster growth rates over time. The final evolved enzyme contained a set of 11 mutations that conferred a 90-fold improvement in substrate utilization, coinciding with the applied selective pressure. This system reduces evolution to a microfluidic algorithm, allowing the experimenter to observe and manipulate adaptation.
Вы эту статью имеет в виду ?
Да, её! Там интересующий меня механизм не описан подробно - видимо, для специалистов всё очевидно и не нуждается в дополнительных прояснениях) вот этот фрагмент имеет отношение к делу, но мне ситуацию не прояснил
The enzyme is challenged to ligate a promoter-containing oligonucleotide substrate to itself by catalyzing nucleophilic attack of the 3′-hydroxyl of the substrate on the 5′-triphosphate of the enzyme. The reaction mixture also contains two polymerase enzymes (reverse transcriptase and T7 RNA polymerase) that amplify any RNA molecules that have acquired the promoter sequence as a consequence of RNA-catalyzed ligation.
Смотрите
1. РНК лигаза + олиг. Олиг содержит два сайта - один для посадки праймера для ревертазы и второй - промотор Т7 полимеразы. Ориентация - для чтения с второй цепи.
2. Лигирование прошло, добавили затравку для ревертазы. Работает ревертаза - образуется двухцепочечный олиг.
3. Он плавится, на второй цепи отжигается РНК полимераза и считывает с второй вновь синтезированной цепи РНК транскрипт. Который будет идентичен (с учетом мутагенеза) исходной РНК лигазе.
Далее цикл повторяется. Главная фишка - расположение в олиге этих двух сайтов. Сначала идет фрагмент для ревертазы, потом т7 промотор - который кончается как раз так, чтобы первый нуклеотид вновь синтезируемой РНК совпадал с первым нуклеотидом рибозима.
Цитата: Питер от апреля 11, 2019, 13:48:20
Смотрите
1. РНК лигаза + олиг. Олиг содержит два сайта - один для посадки праймера для ревертазы и второй - промотор Т7 полимеразы. Ориентация - для чтения с второй цепи.
2. Лигирование прошло, добавили затравку для ревертазы. Работает ревертаза - образуется двухцепочечный олиг.
3. Он плавится, на второй цепи отжигается РНК полимераза и считывает с второй вновь синтезированной цепи РНК транскрипт. Который будет идентичен (с учетом мутагенеза) исходной РНК лигазе.
Далее цикл повторяется. Главная фишка - расположение в олиге этих двух сайтов. Сначала идет фрагмент для ревертазы, потом т7 промотор - который кончается как раз так, чтобы первый нуклеотид вновь синтезируемой РНК совпадал с первым нуклеотидом рибозима.
Спасибо большое, но продолжаю еще тупить! как ревертаза образует двухцепочечный олиг, если исходный содержит в своем составе ДНК, а ревертаза работает только по РНК-матрице (или тут я ошибаюсь?)?
И, если не составит труда, можете подробнее объяснить пункт 3. Спасибо!
А ревертаза и работает в основном по РНК матрице - затравка ДНКовая, но дальше есть переход в РНК-часть. И плюс к этому ревертаза может работать по ДНК - не очень хорошо, но несколько нуклеотидов прочтет.
По п. 3. Смотрите, ревертаза отработала. Получился двухцепочечный олиг. В составе его есть промотор Т7 полимеразы. Причем он граничит с последовательностью РНК лигазы и расположен так, что при считывании образуется последовательность именно исходной РНК лигазы. То есть в качестве матрицы работает вновь синтезированная цепь.
Расплетание цепей - стохастика, РНК-ДНК дуплексы не очень стабильны. Так что полимераза садится вполне эффективно.
Конечно, осталась некоторая туманность, но, кажется, в основных чертах понял)) Огромное спасибо за отзывчивость!