Вопрос по эксперименту Paegel, Joyce (2008)

[goodfellow919]

В книге "Эволюция: классические идеи в свете новых открытий" в подразделе "Эволюция под управлением компьютера" описан интереснейший эксперимент под авторством Paegel, Joyce (2008). К сожалению, в процессе чтения осознал, что не полностью могу схватить то, как именно функционирует размножение используемого в эксперименте рибозима. Отрывок из книги:

Этот рибозим — РНК-лигаза класса I — был искусственно получен в 1993 году. Его функция состоит в том, что он катализирует присоединение (лигирование) другой молекулы РНК к самому себе. Субстратом (присоединяемой молекулой) может служить не всякая цепочка нуклеотидов: она должна содержать участок, комплементарный одному из участков рибозима. Комплементарные участки рибозима и субстрата соединяются водородными связями, образуя «уотсон-криковские» пары. При этом свободные концы субстрата и рибозима оказываются рядом. Концы «сшиваются» — происходит лигирование.
     В качестве субстрата использовался олигонуклеотид смешанной природы: короткая молекула РНК, присоединенная к более длинной молекуле ДНК. Главная хитрость в том, что ДНК-овая часть субстрата содержит промотор, т. е. участок, к которому может прикрепиться фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза. Этот фермент осуществляет транскрипцию, т. е. синтез РНК на матрице ДНК. Без промотора молекула ДНК не может быть транскрибирована.
     Благодаря наличию промотора в молекуле субстрата рибозим РНК-лигаза приобретает требуемое свойство — способность размножаться, но только при условии успешного выполнения рибозимом своей функции.
     Для того чтобы рибозим начал размножаться, нужно добавить в среду два фермента: ДНК-зависимую РНК-полимеразу и обратную транскриптазу — фермент, осуществляющий синтез ДНК на матрице РНК (обратную транскрипцию). Вдвоем эти ферменты успешно осуществляют синтез копий рибозима, но только в том случае, если рибозим предварительно присоединил к себе субстрат с промотором. При размножении копируется не вся молекула (рибозим вместе с присоединенным субстратом), а только сам рибозим.

т. е. лигирующий рибозим присоединяет к себе олигонуклеотид смешанной природы (РНК + ДНК с промотором). с получившимся комплексом (рибозим + смешанный олигонуклеотид) взаимодействуют два энзима (ДНК-зависимая-РНК-полимераза и обратная транскриптаза) и конечным итогом взаимодействия является размножение рибозимной лигазы. но как именно оно осуществляется, если обратная транскриптаза может работать только по РНК-составляющей части получившегося комплекса, а ДНК-зависимая-РНК-полимераза - по ДНК-составляющей?..

Возможно, ответ очевиден, но я почему-то упускаю, не обессудьте, разъясните пожалуйста ) Спасибо!

[Питер]

PLoS Biol. 2008 Apr 8;6(4):e85. doi: 10.1371/journal.pbio.0060085.
Darwinian evolution on a chip.
Paegel BM1, Joyce GF.

Computer control of Darwinian evolution has been demonstrated by propagating a population of RNA enzymes in a microfluidic device. The RNA population was challenged to catalyze the ligation of an oligonucleotide substrate under conditions of progressively lower substrate concentrations. A microchip-based serial dilution circuit automated an exponential growth phase followed by a 10-fold dilution, which was repeated for 500 log-growth iterations. Evolution was observed in real time as the population adapted and achieved progressively faster growth rates over time. The final evolved enzyme contained a set of 11 mutations that conferred a 90-fold improvement in substrate utilization, coinciding with the applied selective pressure. This system reduces evolution to a microfluidic algorithm, allowing the experimenter to observe and manipulate adaptation.

Вы   эту  статью  имеет в  виду ?

[goodfellow919]

Да, её! Там интересующий меня механизм не описан подробно - видимо, для специалистов всё очевидно и не нуждается в дополнительных прояснениях) вот этот фрагмент имеет отношение к делу, но мне ситуацию не прояснил
The enzyme is challenged to ligate a promoter-containing oligonucleotide substrate to itself by catalyzing nucleophilic attack of the 3′-hydroxyl of the substrate on the 5′-triphosphate of the enzyme. The reaction mixture also contains two polymerase enzymes (reverse transcriptase and T7 RNA polymerase) that amplify any RNA molecules that have acquired the promoter sequence as a consequence of RNA-catalyzed ligation.

[Питер]

Смотрите
1.  РНК  лигаза  +   олиг.  Олиг    содержит  два     сайта    -   один   для  посадки  праймера     для   ревертазы  и  второй    -  промотор   Т7  полимеразы.   Ориентация    -  для  чтения с  второй  цепи.
2.  Лигирование  прошло,  добавили  затравку   для    ревертазы.    Работает  ревертаза     -  образуется    двухцепочечный   олиг.
3.   Он  плавится,  на  второй  цепи   отжигается   РНК   полимераза  и      считывает     с  второй   вновь  синтезированной  цепи  РНК    транскрипт.   Который  будет  идентичен  (с  учетом  мутагенеза)    исходной   РНК  лигазе.
Далее    цикл  повторяется.    Главная  фишка   -  расположение в   олиге   этих  двух  сайтов.  Сначала   идет  фрагмент   для  ревертазы,  потом  т7 промотор  -  который   кончается      как  раз  так,  чтобы  первый  нуклеотид   вновь  синтезируемой   РНК  совпадал с  первым  нуклеотидом  рибозима.

[goodfellow919]

Смотрите
1.  РНК  лигаза  +   олиг.  Олиг    содержит  два     сайта    -   один   для  посадки  праймера     для   ревертазы  и  второй    -  промотор   Т7  полимеразы.   Ориентация    -  для  чтения с  второй  цепи.
2.  Лигирование  прошло,  добавили  затравку   для    ревертазы.    Работает  ревертаза     -  образуется    двухцепочечный   олиг.
3.   Он  плавится,  на  второй  цепи   отжигается   РНК   полимераза  и      считывает     с  второй   вновь  синтезированной  цепи  РНК    транскрипт.   Который  будет  идентичен  (с  учетом  мутагенеза)    исходной   РНК  лигазе.
Далее    цикл  повторяется.    Главная  фишка   -  расположение в   олиге   этих  двух  сайтов.  Сначала   идет  фрагмент   для  ревертазы,  потом  т7 промотор  -  который   кончается      как  раз  так,  чтобы  первый  нуклеотид   вновь  синтезируемой   РНК  совпадал с  первым  нуклеотидом  рибозима.

Спасибо большое, но продолжаю еще тупить! как ревертаза образует двухцепочечный олиг, если исходный содержит в своем составе ДНК, а ревертаза работает только по РНК-матрице (или тут я ошибаюсь?)?

И, если не составит труда, можете подробнее объяснить пункт 3. Спасибо!

[Питер]

А    ревертаза  и  работает    в  основном  по  РНК   матрице    -  затравка   ДНКовая,  но    дальше  есть   переход в  РНК-часть.  И  плюс к  этому  ревертаза  может  работать  по  ДНК   -  не  очень  хорошо,  но  несколько  нуклеотидов  прочтет.
По  п.  3.   Смотрите,    ревертаза  отработала.  Получился   двухцепочечный  олиг.    В    составе  его   есть  промотор   Т7 полимеразы.  Причем  он   граничит   с  последовательностью  РНК   лигазы и  расположен   так,     что  при  считывании     образуется  последовательность  именно  исходной  РНК   лигазы.  То  есть в качестве  матрицы   работает  вновь  синтезированная   цепь.
Расплетание   цепей   -  стохастика,    РНК-ДНК   дуплексы  не  очень  стабильны.  Так  что   полимераза   садится вполне  эффективно.

[goodfellow919]

Конечно, осталась некоторая туманность, но, кажется, в основных чертах понял)) Огромное спасибо за отзывчивость!