Самоконтроль в мтДНК-исследованиях

[DNAoidea]

А зачем потом его вновь синтезировать?..

А для наглядности и достоверности. Мало ли? Вдруг где ошибка?

А что, разве синтез ДНК абсолютно достоверный? И потом единственная отпраная точка для него - это та самая ДНК, которая получилась в компьютере - больше черпать для ней информацию неоткуда, то есть добавляя ещё одну стадию, вы ещё больше увеличиваете количество потенциальных ошибок - ведь совершено надёжных систем не бывает...

про условия жизни - ну с трудом верится, что тут была адаптивная эволюция... Уж слишком там мало генов, и все они стабильные-престабильные (в эволюции вообще)

Куда же без неё, родимой. Запхайте популяцию в условия гипоксии - часть низинных линий сразу в расход уйдёт. Дайте нагрузочку глюкозкой - дригие линии элиминируются... Поменяйте аминокислотный состав кормов - другие изменения попрут. Нету в нашей жизни, такой-растакой, ничего стабильного - Земля наша велика и обильна, а порядка на ней нет, не было, и не будет.[/quote]
Ну может быть - спорить не буду - точной информацией не рассполагаю.

[Рома]

И всё-таки не понимаю... Вязяли вы куски - так ведь отсеквенировать не отпцэрив не выдет. Так что же тогда это меняет? Вы пцрите, секвенируете, потом синтезируете всё это заново? А зачем? Куски-то уже готовые есть... Модите их собрать (на компе) в единное кольцо. А зачем потом его вновь синтезировать?..

А для наглядности и достоверности. В своё время мощная компания по рекламе "живительного шпината" началась из-за простой опечатки в справочнике, а тут не количество аскорбинки замеряем. А так - синтезировали ДНК, внедрили её в дехромосомированную митохондрию, запхали в mitohondrial reproduction kit, залили глюкозкой с люцеферином, фотометр присобачили сверху и смотрите - растёт, родимая , размножается и АТФ выделяет. И ни одна зараза не придерётся.

про условия жизни - ну с трудом верится, что тут была адаптивная эволюция... Уж слишком там мало генов, и все они стабильные-престабильные (в эволюции вообще)

ИМХО,  зря Вы так думаете. Загоните популяцию в условия гипоксии - часть линий уйдёт сразу. Нагрузочку глюкозой дайте - уйдёт другая. Заставьте мышцу качать - третьи элиминируются.

[DNAoidea]

А зачем потом его вновь синтезировать?..

А для наглядности и достоверности. Мало ли? Вдруг где ошибка?

А что, разве синтез ДНК абсолютно достоверный? И потом единственная отпраная точка для него - это та самая ДНК, которая получилась в компьютере - больше черпать для ней информацию неоткуда, то есть добавляя ещё одну стадию, вы ещё больше увеличиваете количество потенциальных ошибок - ведь совершено надёжных систем не бывает...

Куда же без неё, родимой. Запхайте популяцию в условия гипоксии - часть низинных линий сразу в расход уйдёт. Дайте нагрузочку глюкозкой - дригие линии элиминируются... Поменяйте аминокислотный состав кормов - другие изменения попрут. Нету в нашей жизни, такой-растакой, ничего стабильного - Земля наша велика и обильна, а порядка на ней нет, не было, и не будет.

Ну может быть - спорить не буду - точной информацией не рассполагаю.

[Рома]

стадию, вы ещё больше увеличиваете количество потенциальных ошибок - ведь совершено надёжных систем не бывает...

Конечно, не бывает. Просто если мы что-то прочитали, а потом записали, и это что-то записанное не отличается от оригинала - запись и чтение произведены, скорее всего, без ошибок. А если мы просто прочитали...

[Рома]

Он просмотрел множество полных сиквенсов и обнаружил, что варианты собранные в популяциях с экстремальными условиями жизни, имеют большее количество несинонимических замен чем в среднем. Но ко времени выхода этой статьи (2004 год) Т.К. уже сделал более тонкое наблюдение, работая с той же самой базой опубликованных сиквенсов. А именно, он заметил что такой перевес есть только у молодых гаплогрупп. А на всем пути от Евы до предковых гаплогрупп большой древности большинство замен - синонимические.

Огромное спасибо, ВЗ, за подробный ответ. Случайно стёр Акробата, как восстановлю, обязательно поделюсь с Вами своим дилетантским мнением по поводу статьи. А пока вопрос - как определяется синоминичность замен в некодирующих областях, и областях, кодирующих тРНК и рРНК?

По предыдущей статье такой вопрос - сообщается о том, что исследователи обнаружили две мутации в позиции 5814, которые до этого считались патогенными. Каким образом исследователи смогли доказать, что не взяли для исследования больную (скомпенсированную или гетероплазмичную) особь?

[Рома]

Трудно предположить что все публикации основаны на достоверных и проверяемых фактах, особенно трудно так думать сейчас, когда выросли и знания и требования.

Тогда к вопросу о неандертальцах. Согласны ли Вы, что на основании анализа мтДНК неандертальца крайне преждевременно делать какие-либо выводы о точном времени расхождения их с современными людьми, особенно, если эти выводы противоречат палеонтологическим и археологическим данным?

Давайте сделаем так. Я приаттачу одну статейку из Ланцета. В свое время обсуждал с врачами. Хочу услышать Ваше мнение. Ну а потом поговорим.

Прочитал. Статья интересная, но видно, что исследователи были крайне ограничены как в силах, так и средствах. Не замерять активность ферментов, не выделять клеточные культуры с последующим измывательством над ними, не искать непосредственные причины различия в максимальной температуре тела у обеих групп (исключать нейро-гуморальные влияния), не оценивать метаболизм антибиотиков, и оксидантное поражение митохондрий... Можно констатировать корреляцию, но делать выводы о причинно-следственной связи, а, тем более, эволюционных причинах, имхо, несколько преждевременно. В общем, ребята молодцы, но надо работать серьёзнее.

[Питер]

[/quote]
Прочитал. Статья интересная, но видно, что исследователи были крайне ограничены как в силах, так и средствах. Не замерять активность ферментов, не выделять клеточные культуры с последующим измывательством над ними, не искать непосредственные причины различия в максимальной температуре тела у обеих групп (исключать нейро-гуморальные влияния), не оценивать метаболизм антибиотиков, и оксидантное поражение митохондрий... Можно констатировать корреляцию, но делать выводы о причинно-следственной связи, а, тем более, эволюционных причинах, имхо, несколько преждевременно. В общем, ребята молодцы, но надо работать серьёзнее.[/quote]
Роман,  браво ! Вы  это Chinnery  напишите,  он  учтет  вашу  критику -)))
Кстати,   исследователи (пять  раз УВЫ)  всегда  ограничены  в  силах  и  средствах.  
Но  предположим,  что  денег   и  сил у  нас  немеряно.  Можно  несколько  вопросов ?
1. Сколько  вариантов  мтДНК  вы  собираетесь  сравнивать  и  по каким  биохимическим параметрам ?
2. Как вы  будете  гарантировать,  что в  изучаемой  клетке  содержится  только  один  тип мтДНК  с  заданной  вами  структурой  ?
3. Как  вы  планируете   проводить  реконструкцию  митохондрий ? Как  обеспечите    стабильность  числа   молекул  мтДНК  в  митохондриях и как  будете  контролировать  этот  показатель ?
4. Как  будете  контролировать  уровень  гетероплазмии  в  экспериментах  по  гетеропазмии ?
5.  Откуда для    системы  трансляции  in  vitro  возьмете   мРНК  для  всех   кодируемых  ядерным  геномом  белков  митохондрий  и  обеспечите  их  посттранляционный  процессинг ?    

Не  проще  ли  пойти  через   путь  создания  цибридов ?

[Рома]

Роман,  браво ! Вы  это Chinnery  напишите,  он  учтет  вашу  критику -)))

А смысл писать ему? Я, полагаю, что он и сам это знает. Вообще-то я полагаю, что некоторые современные генетики схожи с раннесредневековыми астрономами. Да, они, в большинстве своём, понимают, что составление гороскопов не имееет отношения к науке, знают труды античных астрономов, детеизировавших светила... Но на содержание астрономических лабораторий нужны деньги, большие деньги, и если спонсорам нужны гороскопы...

Но  предположим,  что  денег   и  сил у  нас  немеряно.

В первую очередь это значит, что заказчик - крайне серьёзный человек, и за всякую лажу, за преждевременные заявки, бошку открутит на раз. В такой ситуации надо суметь доказательно аргументировать каждую букву в отчёте.  Вот с учётом этого и рассматривайте мои ответы. Лучше я десять раз перестрахуюсь, ибо голова у меня пока одна.

Можно  несколько  вопросов ?
1. Сколько  вариантов  мтДНК  вы  собираетесь  сравнивать  и  по каким  биохимическим параметрам ?

До сколька дотянусь, и по всем системам, в функционировании которых принимаю мтДНК-кодируемые субъединицы.

2. Как вы  будете  гарантировать,  что в  изучаемой  клетке  содержится  только  один  тип мтДНК  с  заданной  вами  структурой  ?

Разработаю методику удаления хромосомы из митохондрии с последующим введением в неё синтезированной де ново.

3. Как  вы  планируете   проводить  реконструкцию  митохондрий ? Как  обеспечите    стабильность  числа   молекул  мтДНК  в  митохондриях и как  будете  контролировать  этот  показатель ?

Реконструкция митохондрий будет проводится методами микрохирургии, стабильность числа молекул как прямым введением, так и выращиванием митохондрий в бесклеточной среде, содержащей необходимые трансляционные факторы и готовые белковые субъединицы. До кучи - лициферин с питательным субстратом.

4. Как  будете  контролировать  уровень  гетероплазмии  в  экспериментах  по  гетеропазмии ?

На досточно большом трупном материале буду брать заборы из различных областей тела. На живом материале - минимум - кровь, соскобы различных слизистых, мышечные биоптаты.

5.  Откуда для    системы  трансляции  in  vitro  возьмете   мРНК  для  всех   кодируемых  ядерным  геномом  белков  митохондрий  и  обеспечите  их  посттранляционный  процессинг ?    

Mitochondrial reproduction kit, предварительно разработанный мною, будет содержать в себе соответствующие белковые субъединицы в достаточном и строго дозированном количестве.

Не  проще  ли  пойти  через   путь  создания  цибридов ?

Проще. Но менее убедительно для заказчика. Мне моя голова дорога как память, и ещё я в неё кушаю.

[Питер]

Роман,    это    программа  на  какой  срок ?  Заказчик  дает  деньги  на 3-5  лет. Больше  - ни-ни.  Что вы  положите  на стол через  три года ?
С  цибридами  это хоть как-то    возможно -  с  одной  мутацией, в варианте 100% мутантной мтДНК versus 100%  мтДНК   того  же    митотипа.  но   без  мутации.  И как  контроль  просто  другой  митотип.  Уже это  реально   очень  большой  объем  чисто  ручной   работы.
Кстати,  вопрос  про    контроль  за  гетероплазмией  касался  не     отбора  материала    из   трупа  -   вы  же  синтезировали   ДНК с  известной  заменой.  Далее   по  вашей  идеологии  надо  смотреть  не  просто   такую  чистую  ДНК  -  а  гетероплазмию,  то есть вводить  смесь  мтДНК   дикого  типа  и мтДНК  с  мутацией.  Потом вы  ведете  клетки в  культуре ,  проходит несколько  делений. Ваше  доказательство  того,  что  в  клетке  имеет  место  быть  именно  ваш заданный %  гетероплазмии ?  И  что  температура  по  палате  одинакова  -  то есть  что каждая  клетка  несет   именно  этот %,   а  не  имеет  место  смесь  клеток с  разнымии митохондриями с  разной  долей мутантной  мтДНК ?

[Рома]

Роман,    это    программа  на  какой  срок ?  Заказчик  дает  деньги  на 3-5  лет. Больше  - ни-ни.  Что вы  положите  на стол через  три года ?

Ну, всё зависит от того, что именно хочет заказчик, и сколько именно он даёт денег.

С  цибридами  это хоть как-то    возможно -  с  одной  мутацией, в варианте 100% мутантной мтДНК versus 100%  мтДНК   того  же    митотипа.  но   без  мутации.  И как  контроль  просто  другой  митотип.  Уже это  реально   очень  большой  объем  чисто  ручной   работы.

Если просто для обзора - можно и так.

Кстати,  вопрос  про    контроль  за  гетероплазмией  касался  не     отбора  материала    из   трупа  -   вы  же  синтезировали   ДНК с  известной  заменой.  Далее   по  вашей  идеологии  надо  смотреть  не  просто   такую  чистую  ДНК  -  а  гетероплазмию,  то есть вводить  смесь  мтДНК   дикого  типа  и мтДНК  с  мутацией.  Потом вы  ведете  клетки в  культуре ,  проходит несколько  делений. Ваше  доказательство  того,  что  в  клетке  имеет  место  быть  именно  ваш заданный %  гетероплазмии ?  

Можно разработать методику маркировки митохондрий, можно ориентироваться на функциональность, ежели мутация в кодирующих участках и влияет на биохимию, в конце-концов, если культура в виде взвеси или монослоя, можно разобрать её на отдельные клетки, кои, в свою очередь, разнеся по разным контейнерам, "мягко разрушить", оставив митохондрии интактными... Вариантов масса. Выбор конкретной реализации - после того, как я увижу заказчика, выслушаю его пожелания, увижу его деньги, и, наконец, самое главное - почитаю соответствующую литературу, бо в данном вопросе я дуб-дубом.

[Рома]

Роман,    это    программа  на  какой  срок ?  Заказчик  дает  деньги  на 3-5  лет. Больше  - ни-ни.  Что вы  положите  на стол через  три года ?

Ну, всё зависит от того, что именно хочет заказчик, и сколько именно он даёт денег.

С  цибридами  это хоть как-то    возможно -  с  одной  мутацией, в варианте 100% мутантной мтДНК versus 100%  мтДНК   того  же    митотипа.  но   без  мутации.  И как  контроль  просто  другой  митотип.  Уже это  реально   очень  большой  объем  чисто  ручной   работы.

Если просто для обзора - можно и так.

Кстати,  вопрос  про    контроль  за  гетероплазмией  касался  не     отбора  материала    из   трупа  -   вы  же  синтезировали   ДНК с  известной  заменой.  Далее   по  вашей  идеологии  надо  смотреть  не  просто   такую  чистую  ДНК  -  а  гетероплазмию,  то есть вводить  смесь  мтДНК   дикого  типа  и мтДНК  с  мутацией.  Потом вы  ведете  клетки в  культуре ,  проходит несколько  делений. Ваше  доказательство  того,  что  в  клетке  имеет  место  быть  именно  ваш заданный %  гетероплазмии ?  

Можно разработать методику маркировки митохондрий, можно ориентироваться на функциональность, ежели мутация в кодирующих участках и влияет на биохимию, в конце-концов, если культура в виде взвеси или монослоя, можно разобрать её на отдельные клетки, кои, в свою очередь, разнеся по разным контейнерам, "мягко разрушить", оставив митохондрии интактными... Вариантов масса. Выбор конкретной реализации - после того, как я увижу заказчика, выслушаю его пожелания, увижу его деньги, и, наконец, самое главное - почитаю соответствующую литературу, бо в данном вопросе я дуб-дубом.

[Рома]

Вопрос, на который я так и не смог найти ответа:
Как на основании мтДНК исследований различить между собой варианты "Африка - родина человечества" и "Африка - медленная зона, убежище для устаревших вариантов со всей Евразии"?

[Питер]

Можно разработать методику маркировки митохондрий, можно ориентироваться на функциональность, ежели мутация в кодирующих участках и влияет на биохимию, в конце-концов, если культура в виде взвеси или монослоя, можно разобрать её на отдельные клетки, кои, в свою очередь, разнеся по разным контейнерам, "мягко разрушить", оставив митохондрии интактными... Вариантов масса. Выбор конкретной реализации - после того, как я увижу заказчика, выслушаю его пожелания, увижу его деньги, и, наконец, самое главное - почитаю соответствующую литературу, бо в данном вопросе я дуб-дубом.

Вы  же  хотите   узнать, как  замена   влияет  на функциональность  митох в  клетке  -  и  планируете  ориентироваться  на  функциональность   для  оценки  гетероплазмии  ?  Весело.  
Кстати,  заказчик  придет к  вам  только в  одном  случае  - если у  вас  уже есть  большой  задел. А  до  этого   за  заказчиком  будете  бегать вы  как  Паниковский  за  Корейко  и  просить "Дай  миллион". И  не вы  будете  слушать  заказчика,  а  заказчик  будет  слушать  вас  и  решать  вопрос  о  миллионе.  И  при  этом  опять же  очень важен  задел -  причем  по  теме исследования.

[Рома]

Вы  же  хотите   узнать, как  замена   влияет  на функциональность  митох в  клетке  -  и  планируете  ориентироваться  на  функциональность   для  оценки  гетероплазмии  ?  Весело.  

Ну, если в опытах на новосинтезированном ферменте мы видим, что он какой-либо субстрат вообще не берёт, то тогда и этот способ сгодится.

Кстати,  заказчик  придет к  вам  только в  одном  случае  - если у  вас  уже есть  большой  задел.

Не-а. Я работаю, точнее служу, совсем-совсем в другой области, и заказчик придёт ко мне, или, точнее, вызовет меня к себе только при весьма и весьма специфических обстоятельствах. И речь о "миллионе" для серьёзного заказчика может идти только в том случае, если ему важен не результат, а сам процесс.
Если же ему действительно понадобится результат, то денег уйдёт не меньше, чем на разработку нового ПТУРА. И речь, безусловно, будет идти не о калибровке "митохондриальных часов".